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非编码RNA之环状RNA最新研究进展
环状RNA（circRNA）是一类不具有5' 末端帽子和3' 末端poly(A)尾巴、并以共价键形成环形结构的非编码RNA分子。
环状RNA是区别于传统线性RNA的一类新型RNA，具有闭合环状结构，大量存在于真核转录组中。大部分的环状RNA是由外显子序列构成，在不同的物种中具有保守性，同时存在组织及不同发育阶段的表达特异性。大部分环状RNA在细胞浆中富集，其丰度有时甚至比相应的线性mRNA高10余倍，这可能是由于环状RNA比线性RNA更稳定造成的。核酸酶往往通过识别线性RNA分子末端发挥作用，环状RNA是一个闭合结构，对核酸酶具有高耐受性，因此比线性RNA更为稳定，这使得环状RNA在作为新型临床诊断标记物的开发应用上具有明显优势。此外，近期研究显示，环状RNA在不同物种中起到miRNA海绵的作用，称之为竞争性內源RNA（ceRNA），能竞争性结合miRNA，从而调控靶基因的表达。这表明环状RNA可能通过竞争性结合疾病相关的miRNA在疾病调控中发挥着非常重要的作用。
1.Science：重磅！揭示环状RNA与大脑功能存在关联
doi:10.1126/science.aam8526
环状RNA能够影响正常的大脑功能，图片来自德国马克斯-德尔布吕克分子医学中心环状RNA生物学培训网络。
Rajewsky团队提出circRNA至少有时发挥着基因调节的作用。作为一种较大的单链环状RNA，Cdr1as有大约1500个核苷酸，可能发挥着像海绵那样吸收微RNA（microRNA, miRNA）的作用。比如，它为一种被称作miR-7的microRNA提供70多个结合位点。microRNA是较短的RNA分子，通常结合到信使RNA（mRNA）的互补序列上，因而控制着细胞产生的特定蛋白数量。
在当前的这项研究中，Rajewsky团队与马克斯-德尔布吕克分子医学中心的Carmen Birchmeier实验室合作重新研究了Cdr1as。论文共同第一作者Monika Piwecka说，“这种特定的circRNA能够在兴奋性神经元中但不在神经胶质细胞中发现。在小鼠和人类的大脑组织中，存在两种结合到它上的microRNA：miR-7和miR-671。”
接下来，Rajewsky和他的合作者们利用基因组编辑技术CRISPR/Cas9选择性地剔除小鼠中的一种环状RNA，即Cdr1as。在这些小鼠中，大多数microRNA的表达在4个研究的大脑区域中未被干扰。然而，miR-7下调表达，miR-671上调表达。这些变化是转录后发生的，这就与Cdr1as通常与细胞质中的这些microRNA相互作用的观点相一致。
2.Nat Biotechnol：环状RNA的检测与研究
doi:10.1038/nbt.2890
环形RNA转录早在上世纪90年代就被发现了，但是限于当时的技术和知识水平，科研工作者并不能对其进行充分而详实的研究。
最近发表在《自然•生物技术》上面的文章为我们提供了一个全新的对环形RNA进行研究的方法与认识。最近的研究已经显示，在哺乳动物细胞中存在多种环形DNA，起作用多为对miRNA行使功能进行调控。尽管，目前只有少部分的环形DNA被发现，其中的大部分还是由于RNA的错误剪接产生的，但是，通过这个新方法可以更有效的细胞内的环形DNA进行捕获与检测。同时由于环形RNA在生物体内的重要作用，因此，在可期的未来，环形RNA的研究将会变得非常重要。
3.农科院破译环状RNA调控猪产肉性状分子机制
doi:10.1093/dnares/dsx022
近日，中国农业科学院北京畜牧兽医研究所“猪基因工程与种质创新团队”和农业基因组研究所“猪基因组设计育种创新团队”合作，历时3年，开发出环状RNA研究平台，绘制猪环状RNA时空图谱，破译环状RNA对猪产肉性状形成调控机制，并构建首个农业动物的环状RNA数据库。该成果最近发表在国际基因组领域知名刊物《DNA research》。唐中林研究员为该文共同通讯作者，梁国明博士后为第一作者。
研究者从猪脂肪、心肌和肝等9种不同组织以及三个发育阶段的骨骼肌中，系统鉴定5934个环状RNA，分子特征分析表明猪环状RNA表达具有高度的时空特异性，与小鼠和人等物种具有较强的保守性；30%以上的环状RNA作为miRNA的sponges对基因表达发挥重要调控作用；发现数百条骨骼肌中特异性丰富表达以及产肉性状相关环状RNA分子。进一步的功能分析表明：在出生后0-30天，circRNA主要调控骨骼肌的生长发育和肌纤维类型转换；30-240天时，circRNA主要调控骨骼肌糖代谢和钙离子信号。最后，研究人员构建了circRNA-miRNA-mRNA多维调控网络和环状RNA数据库。据悉，这是农业动物首张环状RNA的时空图谱和首个数据库。
4.Cancer Res：科学家发现一种促进结肠癌生长和转移的环状RNA
doi:10.1158/0008-5472.CAN-16-1883
在这项研究中，研究人员对结直肠癌疾病中一类新的环状RNA——circCCDC66的功能性作用进行了描述。他们对配对的正常和肿瘤结肠组织样本进行了RNA测序，在测序数据中发现了大量在癌细胞中特异性升高的环状RNA，其中一些得到了实时定量PCR（RT-PCR）的验证。
研究结果表明circCCDC66在息肉和结肠癌中存在表达升高，并且还与不良预后相关。通过在结直肠癌细胞系中进行功能获得性研究和功能缺失性研究，研究人员证明circCCDC66能够控制多个生理过程，其中包括细胞增殖，迁移，侵袭和非贴附性生长。更深度的研究表明circCCDC66通过调节一系列癌基因来发挥它的功能，并且在异种移植肿瘤模型和原位模型中敲低circCCDC66的表达都能够抑制肿瘤生长和癌症侵袭。
5.circRNADb：首个汇总编码蛋白环状RNA的数据库
doi:10.1038/srep34985
2016年10月11日，Nature出版集团子刊Scientific Reports在线发表了南京医科大学Li Yan团队的一项重要环状RNA研究成果，介绍开发了首个汇总可编码蛋白的环状RNA的数据库：circRNADb(Chen et al.， 2016)。（数据库网址：http：//reprod.njmu.edu.cn/circrnadb）
文中作者通过汇总整理，共收集了32914条人类外显子环状RNA记录，每条记录都包括基因组位置信息，RNA编辑情况，所对应的基因组序列，IRES序列元件，预测的ORF以及相关的参考文献。作者发现了有16328条环状RNA包含了编码超过100个氨基酸的ORF，其中7170种环状RNA存在IRES序列元件，基本符合翻译蛋白的特征(Chen et al.， 2016)。
这一数据库提供了一个非常有用的环状RNA研究工具，但本文所引用的文献还没有完全涵盖目前所有的环状RNA研究报道，文中也人为设置了大于300bp（100个氨基酸）作为ORF预测的标准，一定程度限制了该数据库的全面性。相信作者会在后续的工作中逐步完善，使得该数据库能更好的服务广大同行。大家在面对具体的研究对象时也不妨参考一下本文作者的思路，预测分析一下所感兴趣的环状RNA是否携带IRES和ORF。
备注：IRES是internal ribosome entry site的简写，是一种具备募集核糖体并实现核糖体组装和后续阅读框翻译蛋白的RNA调控元件。ORF是Open Reading fr ame的简写，指的是对应于蛋白氨基酸序列的密码子序列，从ATG其实密码子开始，到终止密码子结束。值得一提的是，不是每个ORF都有机会翻译出蛋白质的，还需要有上游的核糖体募集组装以及一些翻译调控元件的存在才可以，IRES就是一类特殊的翻译调控元件。
6.Nature：震惊遗传界的环状RNA
doi:10.1038/nature11928; doi:10.1038/nature11993
在最新一期（2013年2月27日）《自然》（Nature）杂志上，两篇重要的研究论文揭示出一些环状RNA充当分子“海绵”，结合并封闭了称作microRNAs的微小基因调控子。此外，研究人员推测环状RNAs还具有许多其他的功能。其中一篇Nature文章的主要作者、德国Max Delbrück分子医学中心系统生物学家Nikolaus Rajewsky说，这些分子构成了一个“隐秘的未知RNAs平行宇宙”。
这一发现再次提醒人们：RNA并不仅仅是DNA与编码蛋白之间的一个平凡信使。在过去的20年里，研究人员发现了大量的非常规RNA。一些长度意想不到的短，一些则长到令人感到惊讶，而另一些则颠覆常规具有阻止其他RNA链翻译形成蛋白质的功能。几乎所有的RNA都是线性的，为数不多的关于植物和动物中的环状RNAs的记述，也被当做遗传意外或实验人为因素而遭到忽视。
这两篇论文都将焦点放在了由大约1500个核苷酸构成的一个环状大RNA上，它表达于小鼠和人类的大脑中。研究人员发现它包含了70个miR-7的结合位点。MicroRNAs是一些通过结合和阻止mRNA翻译阻断基因表达的短片段RNA。一直以来人们知道，MiR-7的靶标与癌症和帕金森氏病存在着关联。
Hansen研究小组发现这一环状RNA的表达阻断了miR-7。它使得miR-7活性受到抑制，miR-7靶基因表达增高，研究人员推测这是因为这一RNA环捕获和失活了miR-7。Rajewsky研究小组证实，在斑马鱼中表达这一环状RNA或敲除miR-7可以改变大脑发育。
Rajewsky说，环状RNAs也可能是细胞外microRNA的海绵。一些有可能具有病毒microRNAs的结合位点，从而破坏了免疫应答。Rajewsky猜测，环状RNA可能甚至与RNA结合蛋白发挥了互作。Salzman表示同意：“它们数量如此的丰富，可能扮演了多种功能角色。”
7.PLoS ONE：环状RNA比之前认为的更加普遍
doi:10.1371/journal.pone.0030733
霍华德休斯医学研究所的研究员们和斯坦福大学生物化学教授Patrick Brown开展的一项研究发现，数以百计的人类基因转录本似乎由一种将RNA分子剪接成环状的非经典程序所致。对于许多基因，这些环状RNAs组成了所鉴定的所有转录本的相当一大部分，表明这些环状RNAs比之前预想的更为丰富同时可能比之前所想的更为重要。
"这项研究表明，仍然有重要的基础性生物学程序需要通过结合新的统计和计算方法探索发现，"研究的作者之一Juia Salzman说。"这些环状RNAs可能代表了一种尚未被发现的生物学过程。"
8. Cell Res：复旦大学科学家发现外泌体中也含有大量的环状RNA
doi:10.1038/cr.2015.82
近期，中国复旦大学肿瘤研究所的黄胜林和何祥火课题组首次发现了外泌体（exosomes）含有大量 circRNA，相关研究结果发表在Cell Research期刊上，论文标题为“Circular RNA is enriched and stable in exosomes: a promising biomarker for cancer diagnosis”。
这些研究人员从MHCC-LM3肝癌细胞和来自这种肝癌细胞的外泌体中分别提取总RNA（去除核糖体RNA），进行RNA-seq分析，发现外泌体中的circRNA比产生这种外泌体的肝癌细胞中的circRNA要丰富得多。
9. PLoS ONE：发现circRNA有望成为人血液中的一类新型的生物标志物
doi:10.1371/journal.pone.0141214
为了验证从血液检测到的circRNAs的可靠性，研究人员将检测到的circRNAs与ENCODE project数据库来源的小脑，神经组织的circRNAs结果和肝组织的结果进行了比较分析。结果显示，血液中的circRNAs比小脑和肝中的circRNAs表达更高。
通过对circRNAs的来源分析，研究人员发现大部分的circRNAs来源于编码基因的外显子区域和5'UTR区域。另外，这些来源编码基因的circRNAs表达和对应的mRNA表达存在着显着的相关性。 对circRNAs的剪切长度分析显示，在血液中的circRNAs长度与在肝和小脑中检测到的circRNAs长度一致，集中在200-800nt（median=343nt）。值得注意的是，有些基因可以产生多个circRNAs分子，其中，有23个基因每个可以产生超过10个circRNAs。
为了验证测序所得得circRNAs分子的可靠性，研究人员对表达高的8个circRNAs和其线性mRNA分子进行qPCR验证，发现有7个检测结果是一致的。研究人员对这7个circRNAs进行了深入分析：1）核酸外切酶抵抗力检测；2）Sanger测序确认序列信息。结果显示7个分子的验证结果整体错误率很低。
10. Sci Rep：环状RNA在膀胱癌中发挥重要的作用
doi:10.1038/srep30919
2016年8月3日，中国重庆医科大学陈俊霞教授团队在Scientific Reports杂志在线发表了文章，发现了一种被称作circTCF25的环状RNA在膀胱癌中发挥重要作用，并且鉴定出它参与的信号转导通路。
作者们通过对4例膀胱癌样本中分离总RNA，进行高通量筛选，找出20种环状RNA发生最为明显的变化。他们从中选择6种环状RNA，通过进一步验证，发现circFAM169A 和circ-TRIM24在膀胱癌组织中下调最为明显，circTCF25、circZFR 、circPTK2和circBC048201上调最为明显。他们随后分析通过DIANA-miRPath通路分析揭示出它参与的信号转导通路。
11.挑战常规！环状RNA也可能表达肽分子
doi:10.1016/j.bbagrm.2016.07.009
2016年7月19日，研究人员在Biochimica et Biophysica Acta期刊发表了关于环状RNA表达肽分子的综述论文，为环状RNA功能研究提供了新思路。
文中他们系统分析了已发表的各种环状RNA表达肽分子的证据和线索，如1984年，H. SCHELLEKENS等就曾在Nature上发表文章报道发现丁型肝炎病毒（HDV）的环状RNA可以表达一种长122个氨基酸的肽分子。2014年，Tauqeer Ahmad等人在PNAS期刊上的发表的一篇文章证明在水稻中造成水稻黄斑病变的拟病毒 RYMV（rice yellow mottle virus (sobemovirus)）利用环化后重叠密码子的机制让220nt的环状RNA表达生成16kD大小的肽分子。在哺乳动物系统以及体外实验中也发现了一些环状RNA可表达肽分子的证据和线索。