常见问题

测序过程中最常见的问题是双峰，导致整个结果不可用。明明挑的是单克隆，为什么还会碰到双峰呢？

其实导致双峰的原因是多种的，双克隆只是其中的一原因，而且不同的起因在峰图上表现出不同的特征，通过对峰图的分析找出双峰的起因是解决问题最直接的方法。

双克隆（连接到载体测序）

峰图上最显著的特征是前几十bp峰形单一（与测序引物和克隆位点的距离有关，一般10-60bp），在其后的峰图出现重叠峰。
如果双向测序则两端引物测序结果都为前几十bp峰形单一，其后的峰图出现重叠峰。

原因：

如果模板中有两个克隆，它们在载体上的序列是相同的，只是插入的片段方向相反或不同，所以在使用通用引物测序时，前几十bp正常（载体上的序列），在多克隆位点后开始出现双峰。

解决方法：

重新划板，取单克隆。

双模板（ＰＣＲ样品测序）

峰形从一开始就比较乱

原因：首先ＰＣＲ扩增出来的条带不是单一条带，并且在纯化过程中没有被分离开

解决办法：

如果扩增条带间在琼脂胶上的差异较大，可以通过割胶纯化回收的方式,如果条带间的差异不大，则只能连接到载体上挑取单克隆测序了.